Efectividad de métodos para desinfestar semillas de <em>Laelia autumnalis</em> para la conservación en nitrógeno líquido
Resumen
Introducción:

Laelia autumnalis es una orquídea nativa de México amenazada por la pérdida de su hábitat. Para la conservación de esta especie es necesario evaluar la efectividad de métodos de desinfección y secado para aplicar técnicas de crioconservación y cultivo in vitro.

Método:

En un primer experimento, se consideró la técnica de inmersión directa en nitrógeno líquido para optimizar el almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, la germinación asimbiótica fue afectada por el hongo Alternaria sp., motivo por el cual se realizó un segundo experimento con dos ensayos para evaluar la viabilidad y germinación asimbiótica de las semillas en función de los desinfectantes hipoclorito de calcio al 1% e hipoclorito de sodio comercial al 15% y los métodos de secado con aire en la campana de flujo laminar, gel de sílice y bomba de vacío, antes y después de la inmersión en nitrógeno líquido.

Resultados:

Los desinfectantes hipoclorito de calcio e hipoclorito de sodio disminuyeron la viabilidad en 49 y 37%, respectivamente, así como los métodos de secado con aire en la campana de flujo laminar y bomba de vacío con 36 y 28%, respectivamente. La pérdida de viabilidad fue menor cuando se desinfectó después de la inmersión en nitrógeno líquido; la germinación se estimuló con hipoclorito de sodio (100%).

Conclusión:

Las semillas de L. autumnalis deben desinfectarse con hipoclorito de sodio y secarse con aire de la campana de flujo laminar después de la crioconservación por inmersión directa en nitrógeno líquido para evitar daños en los tejidos.

Abstract
Introduction:

Laelia autumnalis is an endemic orchid species from Mexico which is threatened by its habitat loss. In order to preserve this species disinfestation and adequate drying methods are necessary developed of cryopreservation and in vitro culture technics.

Method:

For a good long-term storage optimization the direct immersion technic in liquid nitrogen was considered in the first experiment (E1), however, asymbiotic germination was affected by the fungi Alternaria sp.; because of that, a second experiment was carried out with two assays in order to evaluate the seed viability and asymbiotic germination based on 1% (w/v) of calcium hypochlorite (CaCl2O2) and 15% (v/v) of commercial sodium hypochlorite (NaClO) as disinfection methods and using the air of laminar air-flow (A), silica gel (G) and vacuum pump (V) as drying methods before (E2) and after (E3) liquid nitrogen immersion (LN).

Results:

Viability was reduced in 49% and 37% by CaCl2O2 and NaClO, respectively, while A and V drying methods were caused the highest viability loss (36 and 28%), respectively. The loss of viability in E3 was lower than E2 and it was observed a stimulation by NaClO in germination (100%).

Conclusion:

These seeds must be disinfected with NaClO and dried using the air of laminal air-flow after cryopreservation by direct immersion in order to avoid plant tissues damage.

Palabras clave:
    • crioconservación;
    • almacenamiento de semillas;
    • desinfestación y secado.
Keywords:
    • cryopreservation;
    • seed storage;
    • disinfestation and drying.

Introducción

Las poblaciones silvestres de Laelia autumnalis, una orquídea nativa de México, han estado sujetas al cambio en el uso del suelo y a la extracción masiva e ilegal de individuos reproductivos para satisfacer la demanda de los mercados. De seguir con esta actividad, esta especie pronto formará parte de la lista de especies amenazadas (Hernández-Muñoz et al., 2013). Las inflorescencias de esta orquídea contienen flores púrpura vistosas, de diversas tonalidades, formas, tamaños y aromas, que se usan en festividades tradicionales por distintos pueblos indígenas desde la época prehispánica (Hernández-Muñoz et al., 2017). Para preservar el germoplasma de especies en peligro de extinción y amenazadas, es necesario establecer estrategias basadas en el desarrollo y optimización de protocolos para conservación y propagación in vitro (Popova et al., 2016) acompañados de ensayos para reintroducir plantas en sitios de restauración (Bustam et al., 2015).

Los bancos de semillas son una opción efectiva y viable para la conservación ex situ de plantas como las orquídeas (Merritt et al., 2014), ya que la tolerancia de sus semillas a la desecación parece común y generalizada, lo que incrementa el potencial de almacenamiento entre -20 y 5 °C (Ossenbach et al., 2007). Sin embargo, las semillas de algunas especies de orquídeas tienen poca vida de almacenamiento (Hay et al., 2010), porque son pequeñas (± 0.04 mm) y carecen de endospermo, que es sustituido por embriones globulares (indiferenciados) dentro de testas relativamente transparentes con pocas células que contienen algunas reservas de lípidos (Hosomi et al., 2012; Piri et al., 2013).

Para semillas con poca vida de almacenamiento, se han obtenido métodos más efectivos y económicos para la conservación a largo plazo a través de la crioconservación. Como sucedió en las orquídeas Cymbidium macrorhizon y Bletilla formosana donde se utilizaron vitrificación y desecación para obtener porcentajes de viabilidad altos (82 y 86.80%, respectivamente) después de su almacenamiento en nitrógeno líquido (Hirano et al., 2011; Rung-Yi et al., 2013). Después de la conservación a largo plazo y durante la germinación asimbiótica, los embriones pueden presentar más daños, ya que las semillas de orquídeas tienen que ser desinfestadas para evitar la contaminación durante el cultivo in vitro (Billard et al., 2014); tomando en cuenta que esta etapa es un factor crítico del protocolo de crioconservación debe ser estrictamente controlada (Pence y Sandoval, 2002).

La superficie de la testa seminal al igual que otros tejidos vegetales albergan fácilmente bacterias, hongos y esporas, lo que dificulta su preparación y crecimiento mediante micropropagación aséptica (Stubblefield et al., 2015), debido al éxito limitado en los protocolos de cultivo de tejidos se deben hacer pruebas con los compuestos o agentes desinfestantes como el hipoclorito de calcio y sodio, el cloruro de mercurio, los antibióticos y fungicidas para eliminar a los microorganismos sin afectar a los tejidos (Mng’omba et al., 2012; Yildiz et al., 2012). Aunque, estos desinfestantes pueden afectar la viabilidad como sucedió en semillas de E. adenocaula, donde la viabilidad aumentó 48.2% cuando utilizó Tween 80 en comparación con el 24.1% que se obtiene al desinfectar con Ca(OCl)2 (Aguilar-Morales et al., 2016). Por el contrario, existen reportes en donde el uso de desinfestantes aumenta el porcentaje de viabilidad y germinación como en las semillas de Paphiopedilum donde la tinción de embriones con sales de Cloruro de 2,3,5-Trifenil-Tetrazolio (TTC) fue 44.1% y germinación del 58.1% después del pretratamiento con NaClO al 0.5% durante 60 min, ya que al aumentar la dosis 1.0 o 1.5% y el tiempo de exposición 60 y 20 min, respectivamente estos disminuyeron, la viabilidad fue del 21.7 y 25.3% y la germinación fue de 11.7 y 12.8%, respectivamente (Fu et al., 2016).

Los datos sobre la viabilidad de las semillas de orquídeas nativas de México después de años o décadas de almacenamiento son relativamente escasos, a pesar de que, determinar la viabilidad de las semillas y establecer el método de desinfestación, son actividades fundamentales para desarrollar el método de conservación a largo plazo para la especie de interés en banco de germoplasma. Esta falta de información puede ocasionar que las semillas se almacenen a temperatura y humedad inadecuadas lo que provocaría pérdida de viabilidad (Aguirre-Bolaños et al., 2017). Por lo tanto, el objetivo de la presente investigación, fue evaluar el tipo de desinfectante y método secado en la viabilidad y germinación de semillas de Laelia autumnalis antes o después de la inmersión en nitrógeno líquido (-196 °C).

Método

Inmersión directa de semillas sin desinfectar (E1). Este experimento consistió en un ensayo preliminar en el cual se usaron los frutos maduros (cápsulas) de tres plantas de L. autumnalis pertenecientes al Banco de Germoplasma del Sistema Nacional de Recursos Fitogenéticos (SINAREFI). La semilla polvo (con humedad del 3%) se almacenó 30 d en recipientes de cristal de 14 mL de capacidad con tapa de corcho a temperatura ambiente (24 ± 1 ºC). En el primer experimento se colocaron 40 mg de semilla polvo en dos crioviales de polipropileno de 2 mL de capacidad (Sarstedt®), 20 mg por criovial. Los crioviales se almacenaron durante 24 h en nitrógeno líquido (NL) aplicando la técnica de inmersión directa (ID). Transcurrido el tiempo de inmersión los crioviales se expusieron a la corriente de aire de la campana de flujo laminar durante 2 min. Con base en los resultados de este ensayo, se planteó la necesidad de desinfectar y secar las semillas antes o después de la inmersión en NL.

Desinfestación de semillas antes de la inmersión en nitrógeno líquido (E2). Se tomaron ocho muestras de semillas de 20 mg, cada muestra se colocó en sobres de papel filtro estéril de 1 cm2; cuatro sobres se desinfestaron con hipoclorito de sodio comercial (NaClO) al 15% (v/v 6% de i. a.) y cuatro con hipoclorito de calcio (CaCl2O2) al 1% (p/v) durante 15 min. Todos los sobres se enjuagaron en tres ocasiones con agua estéril, en condiciones asépticas. Seis muestras (tres por cada tipo de desinfectante) se secaron con los métodos siguientes: a) aire de la campana de flujo laminar sobre papel filtro en caja de petrí durante 20 min; b) en contenedor de cristal herméticamente cerrado con 50 g de gel de sílice durante 20 min y c) en matraz kitasato conectado a bomba de vacío en donde se realizó vacío durante 10 min. Después del secado, las semillas de cada sobre se colocaron en crioviales de polipropileno de 2 mL de capacidad (Sarstedt®) y se sumergieron en NL durante 24 h; junto con una muestra de semillas de cada tipo de desinfectante sin secar (Fig. 1). En total se evaluaron ocho tratamientos, que resultaron de la combinación de dos productos (hipoclorito de sodio e hipoclorito de calcio), tres métodos de secado (campana de flujo laminar, gel de sílice y bomba de vacío); además, se consideraron dos tratamientos de semillas desinfestadas (con NaClO y CaCl2O2) sin secado. El diseño experimental fue completamente al azar con arreglo factorial de tratamientos (Fig. 1).

Ruta criogénica en la técnica de inmersión directa para semillas maduras de Laelia autumnalis.

Sin desinfectar (E1), desinfestadas antes (E2) y después (E3) de la inmersión en nitrógeno líquido.

TTC = Prueba de viabilidad con sales de Cloruro de 2, 3, 5-Trifenil-Tetrazolio (TTC) al 1%.

Desinfestación de semillas después de la inmersión en nitrógeno líquido (E3). Se colocaron dos muestras de 20 mg de semillas en crioviales de plástico con capacidad para 2 mL y se sumergieron en NL durante 24 h. Después, una muestra se desinfestó con NaClO al 15% y otra en CaCl2O2 1% durante 15 min, posteriormente se lavaron tres veces con agua esterilizada en la campana de flujo laminar. En este ensayo el diseño experimental fue completamente al azar (Fig. 1).

En los tres ensayos, la unidad experimental fue de 0.3 mL de una suspensión de 5 mg de semilla polvo en 1 mL de agua para la variable viabilidad; y de un área de 1 cm2 de caja petrí con 15 mg de semilla cultivadas en medio MS, para la variable germinación in vitro. Cada tratamiento se repitió tres veces.

Variables evaluadas

Viabilidad de semillas. De las muestras de 20 mg de cada tratamiento de los tres experimentos se tomaron 5 mg de semillas, se colocaron en tubos Eppendorf® de plástico de 2 mL de capacidad y se adicionó 1 mL de solución de sacarosa a 1% para mejorar la permeabilidad de la testa. Después de 24 h, la sacarosa se sustituyó por 1 mL de solución de sales de Cloruro de 2,3,5-Trifenil-Tetrazolio (TTC) al 1% (Lauzer et al., 1994). Los tubos se mantuvieron a 40 °C durante 24 h. Para determinar la viabilidad de las semillas, de cada tratamiento se tomaron 0.3 mL de la mezcla de semillas y se colocaron en portaobjetos, de cada portaobjetos se seleccionaron tres áreas de 1 cm2 y se tomaron imágenes digitales en microscopio estereoscopio marca Leica® modelo S6D con analizador de imágenes conectado a cámara Leica® EC3. En cada imagen digital se registró el número de semillas totales, teñidas de rojo carmín intenso (viables con tejido vivo y vigoroso), teñidas de rojo o rosa (potencialmente viables, tejido en deterioro) debido a la reducción del tetrazolio por la actividad respiratoria de las células (ISTA, 2015) y no teñidas o blancas (semillas no viables, tejido muerto). Con la suma de semillas de cada tipo se obtuvo el número total de semillas, que se usó como denominador para obtener los porcentajes de semillas viables, potencialmente viables y no viables de la siguiente forma: semillas viables (%) = (número de semillas viables/número total de semillas en 1 cm2) X 100. En cada variable (semillas viables, potencialmente viables y no viables) se utilizó el mismo procedimiento.

Germinación in vitro. El resto de las semillas (15 mg) de todos los tratamientos de los tres ensayos se suspendieron por separado en crioviales con 1 mL de agua esterilizada y posteriormente se colocaron en cajas de petrí con 20 mL de medio de cultivo Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962) adicionado con 30 g L-1 de sacarosa, 100 mg L-1 de mio-inositol, 0.4 mg L-1 de tiamina y 6 g L-1 de agar. Las cajas fueron colocadas en el cuarto de incubación a temperatura de 24 ºC ± 1 y con fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas oscuridad con intensidad lumínica de 40 µM m-2 s-1. A los 8 días después de la siembra (dds), de los 15 mg de semillas en la caja petrí de cada tratamiento se seleccionaron tres áreas de 1 cm2 y mediante observación en el microscopio estereoscópico se cuantificó el número de semillas germinadas. El porcentaje de germinación para todas las muestras se obtuvo de manera similar a lo descrito para porcentaje de viabilidad de las semillas.

Análisis estadístico. A los datos obtenidos en porcentajes de las variables respuesta de los experimentos E2 y E3 se les aplicaron las pruebas de Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov para confirmar la distribución normal y las de Barttlet y Levene para confirmar la homogeneidad de varianzas de las variables y los tratamientos. En E2 se llevó a cabo un anova factorial (α = 0.05) para evaluar el efecto del tratamiento desinfectante (n = 2) en interacción con el tratamiento de secado (n = 4) previo a la inmersión en NL, en el porcentaje de semillas viables y germinadas, en total se probaron ocho tratamientos con tres repeticiones; además se utilizó la prueba de Tukey para la comparación de medias entre tratamientos. En E2 también se realizó análisis de regresión (P ≤ 0.05) entre el porcentaje de semillas potencialmente viables con el porcentaje de semillas germinadas in vitro, de las muestras desinfectadas con CaCl2O2 y secadas antes de la inmersión en nitrógeno líquido. En E3 se calcularon las pruebas t de Student para establecer si existían diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de semillas viables y no viables y la germinación in vitro por efecto del tipo de desinfectante después de la inmersión en NL. Estos análisis se efectuaron con el programa SAS (Statistical Analysis System) versión 9.0 (Statistical Analysis System, 2002).

Resultados y Discusión

Inmersión directa de semillas sin desinfestar (E1). En los resultados del ensayo preliminar la obtención de imágenes de las semillas de L. autumnalis con 3% de humedad, almacenadas por 30 d sin tratar (muestra inicial), tratadas con TTC permitió la separación de las semillas en tres categorías: viables con embriones teñidos de rojo intenso carmín (88%), potencialmente viables con embriones de color rosa en proceso de deterioro (8%) y no viables con embriones blancos (4%) (Fig. 2). La presencia de semillas de baja viabilidad (embriones rosas) es común en los frutos de orquídeas, por esto es importante determinar la calidad fisiológica antes y después de la conservación (Hosomi et al., 2012).

Semillas de Laelia autumnalis teñidas por efecto de las sales de TTC.

Semillas viables (A), semillas potencialmente viables (B) y semillas no viables (C) después de la inmersión en NL.

El porcentaje de semillas viables obtenido (88%) indica que L. autumnalis tiene capacidad de reproducción. Estos datos son similares a los obtenidos para L. autumnalis en otros reportes donde se han registrado porcentajes de germinación del 80 y 100% con fotoperiodos de 24 h luz y 16/8 h (luz/oscuridad) respectivamente (Vergara-Galicia et al., 2010); en otras orquídeas como Dendrobium officinale se han reportado valores de germinación superiores (98.47 y 99.05%) al asociar la germinación in vitro con las cepas del hongo micorrízico JC-02 y JC-05 (Tan et al., 2014).

Después de la inmersión en NL de semillas de L. autumnalis sin desinfestación, se observó que, las estructuras de resistencia les permiten a los hongos tolerar bajas temperaturas (de Araújo et al., 2015), ya que, las semillas presentaron formación de micelio de color blanco algodonoso que inició entre los 2 y 10 días después de la siembra (dds) con cambio a tonalidad ocre. A los 15 dds el micelio invadió por completo las cajas petrí y evitó la germinación. Aunque se sabe que los microorganismos se encuentran presentes en todos los órganos de las orquídeas en raíces, cápsulas, semillas y también en plántulas cultivadas in vitro (Ávila-Díaz et al., 2013), la exposición rápida al nitrógeno líquido y el recalentamiento pueden inducir agrietamiento de la testa produciendo daño en las semillas, lo que probablemente permite la eclosión de microorganismos y la contaminación (Khanna et al., 2014).

En éste estudio, el hongo contaminante se identificó como Alternaria sp, ya que registró colonias con crecimiento radial de color oscuro así como conidióforos, la mayoría simples, cortos o alargados, generalmente una cadena ramificada de conidios; conidios café oscuro, normalmente con las células transversales y longitudinales septadas; de diversas formas, ovoclavadas, elípticas u ovoides, con frecuencia acropétalas en largas cadenas; características que coinciden con las descritas por Barnett y Hunter (1998) para este género (Fig. 3).

Estructuras del hongo Alternaria sp., identificado como agente contaminante en cultivo in vitro de semillas de L. autumnalis después de la inmersión directa en nitrógeno líquido.

A) Cadena de conidios, y B) Conidio con las células transversales y longitudinales septadas.

La presencia del hongo Alternaria también se ha confirmado mediante evidencia molecular en semillas de Laelia speciosa desde la germinación hasta los primeros estadios de desarrollo in vitro, sin embargo, no formó pelotones característicos de hongos micorrízicos por lo que se reporta que actúa como patógeno de orquídeas (Ávila-Díaz et al., 2013). En semillas de Jatropha curcas después de la crioconservación se reportó la presencia de hongos del género Aspergillus en forma predominante durante los períodos de almacenamiento a 30, 60 y 90 días (Goldfarb et al., 2010), y se confirmó la tolerancia de este hongo a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 ºC).

Desinfestación de semillas antes de la inmersión en nitrógeno líquido (E2).

Semillas viables. Los factores tipo de desinfectante y método de secado influyeron de manera independiente y en interacción en la viabilidad de las semillas (Cuadro 1). La desinfestación con NaClO redujo la viabilidad en comparación con CaCl2O2 (Fig. 4), esto concuerda con otros reportes donde se asoció la disminución de la viabilidad de 70 a 18% en semillas de Paphiopedilum wardii Sumerh con hipoclorito de sodio a 1.0% durante 90 min, que podría deberse al daño de la semilla causado por el periodo de los tratamientos (Zeng et al., 2012); mientras que el incremento del 5 al 10% en la concentración de CaCl2O2 provocó disminución de la viabilidad de 73 a 14% en semillas de Phalaenopsis spp. (Mweetwa et al., 2008). El NaClO erosiona parcialmente la cubierta seminal y mejora la permeabilidad al oxígeno; también es posible que el NaClO alcance algunas células del embrión y afecte las propiedades de la membrana celular, por lo tanto, tenga efectos perjudiciales sobre las actividades metabólicas de las células tratadas con NaClO (Kaneko y Morohashi, 2003).

Análisis de varianza de porcentaje de semillas viables de Laelia autumnalis en los factores tipo de desinfectante y método de secado antes de la inmersión en nitrógeno líquido.
Fuente de variabilidad GL SC CM F Pr>F
Desinfectante (D) 1 2433.71 2433.71 111.71 <.0001
Método de secado (S) 3 7311.86 2437.28 111.88 <.0001
D*S 3 816.50 272.16 12.49 0.0002

GL= Grados de Libertad, SC= Suma de Cuadrados, CM= Cuadrado Medio, F= Valor de F, Pr= Probabilidad.

Viabilidad de semillas de Laelia autumnalis en función del tipo de desinfectante y método de secado antes de la inmersión en nitrógeno líquido. Las semillas fueron teñidas con las sales de TTC (E2).

DMS = Diferencia Mínima Significativa. CV = Coeficiente de Variación. zMedias con letra igual entre barras no difieren estadísticamente (P ≤ 0.05). Las líneas sobre cada barra indican la desviación estándar.

En la presente investigación fue evidente la muerte de los embriones de las semillas sin secar, ya que es posible que el agua promoviera la formación intracelular de cristales de hielo durante la inmersión en NL (Fig. 4). La viabilidad fue estadísticamente superior (P > F = 0.001; G.L. = 7; P ≤ 0.05) en semillas secadas con gel de sílice en contraste con aquellas secadas al aire de la campana de flujo laminar y con bomba de vacío. El tratamiento de desinfección con CaCl2O2 y secado con gel de sílice registró el porcentaje mayor (60.84) de semillas viables, estadísticamente igual al tratamiento con CaCl2O2 y secado con aire de la campana de flujo laminar (Fig. 4). En Bletilla formosana las semillas con contenido de agua del 48.9% presentaron una viabilidad y germinación de 1.8 y 2.3% después de la inmersión en NL; mientras que las semillas de la misma especie sometidas a deshidratación por 24 h o a gel de sílice por 1 h antes de la inmersión en NL mostraron incrementos en la viabilidad 44.9 y 86.8% (Rung-Yi et al., 2013). En general las semillas de muchas orquídeas son tolerantes a la desecación (Merritt et al., 2014), aunque la inmersión en productos como el CaCl2O2 y NaClO puede ocasionar blanqueamiento del revestimiento de las semillas e hinchazón de los embriones, además de la degradación de la lignina en la testa de las semillas (Bae et al., 2014; Barsberg et al., 2013).

Se ha documentado que las técnicas de desinfestación y tratamientos previos al cultivo in vitro pueden reducir la contaminación, aunque generan impactos negativos en las plántulas desarrolladas (Teixeira da Silva et al., 2016). En Cattleya, también se reporta la presencia de semillas que se tornan de color rosa después de la tinción con tetrazolio, la técnica se modificó para 10 mg de semillas, se incubaron en solución de sacarosa al 10% (p/v) por 24 h a 25 °C, y se lavaron con agua destilada para adicionar solución de TTC al 1% por 24 h a 40 °C; la germinación in vitro corroboró que estás eran viables (Hosomi et al., 2012).

Semillas potencialmente viables. La desinfestación con NaClO y secado con gel de sílice y con CaCl2O2 y secado con bomba de vacío, presentaron los porcentajes mayores de semillas en proceso de deterioro (29.23 y 23.52, respectivamente) (Fig. 5). La presencia de semillas potencialmente viables se registró también en las semillas sin tratar (muestra inicial). Esto confirma que la viabilidad de las semillas es afectada por otros factores además de los descritos en este estudio, como maduración de la cápsula ya que parte del extremo floral se extiende hasta el pedúnculo, por lo que, en el momento de la cosecha las semillas pueden haber alcanzado diferentes niveles de madurez y afectar la respuesta en la prueba de TTC (Hosomi et al., 2012).

Semillas de Laelia autumnalis potencialmente viables en función del tipo de desinfectante y método de secado antes de la inmersión en nitrógeno líquido. Las semillas fueron teñidas con las sales de TTC (E2).

DMS = Diferencia Mínima Significativa. CV = Coeficiente de Variación. zMedias con letra igual entre barras no difieren estadísticamente (P ≤ 0.05). Las líneas sobre cada barra indican la desviación estándar.

Semillas no viables. Con excepción de los tratamientos sin secado, en donde murieron todos los embriones, la cantidad de semillas no viables fue mayor (64 y 63%, respectivamente) al combinar la desinfestación con NaClO y secado con bomba de vacío y corriente de aire (Fig. 6). Estos dos métodos de secado son más rápidos que el secado por gel de sílice, pero son más agresivos y reducen la viabilidad de las semillas de Laelia autumnalis. El NaClO también ocasionó la pérdida de viabilidad en semillas de las orquídeas epifitas Bifrenaria nodora, Cattleya bicolor, Cattleya inetmedia, Encyclia pygmaea, Epidendrum fulgens, Oncidium pumilum y Pleurothallis gumacea y su efecto estuvo relacionado con la concentración y tiempo de exposición (Álvarez-Pardo et al., 2006); además, es posible que el triple enjuague que se aplicó a las muestras desinfestadas, no eliminó completamente todos los componentes de la solución de NaClO que mantuvo efecto residual en las semillas (Silva et al., 2015).

Semillas no viables de Laelia autumnalis en función del tipo de desinfectante y método de secado antes de la inmersión en nitrógeno líquido. Las semillas fueron teñidas con las sales de TTC (E2).

DMS = Diferencia Mínima Significativa. CV = Coeficiente de Variación. zMedias con letra igual entre barras no difieren estadísticamente (P ≤ 0.05). Las líneas sobre cada barra indican la desviación estándar.

La asociación entre el CaCl2O2 y secado con gel de sílice produjo la menor pérdida de viabilidad (26%) por lo que puede ser considerado como el método más adecuado para la desinfestación de semillas antes de la crioconservación (Fig. 6).

Germinación in vitro. El tipo de desinfectante y método de secado afectaron de manera independiente y en interacción la germinación in vitro de semillas expuestas en NL por 24 h (Cuadro 2). Esto indica que hay correspondencia entre las pruebas de viabilidad y germinación de las semillas. Datos similares, se encontraron en la orquídea Dactylorhiza fuchsii que registró porcentajes de germinación de 89.7 y de viabilidad de 84.8 (Colville et al., 2016).

Análisis de varianza de porcentaje de germinación de semillas de Laelia autumnalis en función del tipo de desinfectante y método de secado antes de la inmersión en nitrógeno líquido.
Fuente de variabilidad GL SC CM F Pr>F
Desinfectante (D) 1 6979.58 6979.58 1441.98 <.0001
Método de secado (S) 3 18958.37 6319.45 1305.59 <.0001
D*S 3 2341.92 780.64 161.28 <.0001

GL= Grados de Libertad, SC= Suma de Cuadrados, CM= Cuadrado Medio, F= Valor de F, Pr= Probabilidad.

La germinación in vitro se redujo 34.1% en promedio al desinfestar las semillas con NaClO, comparadas con las desinfestadas con CaCl2O2. Los métodos de secado también influyeron en la germinación, las semillas secadas con aire de la campana de flujo laminar germinaron en promedio 8 y 30% más que las secadas en gel de sílice y bomba de vacío. El tratamiento de desinfestación con CaCl2O2 y el secado en aire de la campana de flujo laminar, promovió la germinación de las semillas (94.48%); la sustitución de NaClO con este mismo método de secado redujo en 47.8% la germinación (Fig. 7).

Germinación in vitro de semillas de Laelia autumnalis en función del tipo de desinfectante y método de secado antes de la inmersión en nitrógeno líquido (E2).

DMS = Diferencia Mínima Significativa. CV = Coeficiente de Variación. zMedias con letra igual entre barras no difieren estadísticamente (P ≤ 0.05). Las líneas sobre cada barra indican la desviación estándar.

Aunque los embriones de las semillas potencialmente viables presentaron tinción en la prueba de TTC (color rosa), se infiere que sólo algunas pudieron germinar, ya que el porcentaje de germinación estuvo correlacionado de manera negativa (R2 = -0.88, P≤0.05) con la presencia de semillas potencialmente viables (Fig. 8). Estos resultados contrastan con los obtenidos con Cattleya walkeriana y C. tigrina en donde fue necesario considerar las semillas viables (color rojo) y potencialmente viables (color rosa) para calcular con mayor precisión el porcentaje de germinación (Hosomi et al., 2011).

Modelo de regresión para estimar la relación entre el porcentaje de semillas potencialmente viables y el porcentaje de germinación in vitro (E2) de semillas de L. autumnalis en nueve muestras desinfectadas con CaCl2O2 antes de la inmersión en nitrógeno líquido.

Desinfestación de semillas después de la inmersión en nitrógeno líquido (E3)

Viabilidad de semillas. La desinfestación de las semillas después de la inmersión en NL no afectó la viabilidad, ya que el número de semillas viables por efecto de los desinfectantes CaCl2O2 y NaClO fue superior a 90% y estadísticamente similar entre éstos (Fig. 9A). Por lo cual, se considera que los resultados obtenidos con este método (E3) son superiores a los obtenidos en el experimento 2 (E2) porque evita humedecer y secar la semilla antes de la inmersión en nitrógeno líquido; es probable que el tipo de desinfestante y método de secado previos a la inmersión en NL causen algún daño a los tejidos de la testa y el embrión lo que disminuye la viabilidad y germinación de las semillas de L. autumnalis. La testa de las orquídeas está formada principalmente por lignina, proteínas y celulosa (Barsberg et al., 2013), funciona como protección para el embrión al retener la humedad, por lo que, aumenta la durabilidad y viabilidad de las semillas (Aybeke, 2014).

Efecto del tipo de desinfectante en la viabilidad de las semillas de L. autumnalis desinfestadas después de la inmersión en NL.

A) Semillas viables, B) Semillas no viables (E3).

En el tratamiento con CaCl2O2 no se observaron semillas sin teñir o no viables (Fig. 9B), lo que sugiere que el CaCl2O2 afectó la composición química o física de la testa de las semillas, permitió la penetración del TTC y mejoró la tinción de los embriones. Algunas sustancias que se utilizan como desinfectantes, pueden producir blanqueamiento en las semillas y generar sesgos en las pruebas de viabilidad (Lemay et al., 2015); situación que se ha reportado en semillas de otras orquídeas como Paphiopedilum donde el NaOCl provocó el blanqueamiento de la testa (Fu et al., 2016), además, algunos desinfestantes como el NaOCl provoca la escarificación de algunas semillas como se reportó para la orquídea Dactylorhiza fuchsii (Custódio et al., 2016).

Germinación in vitro de semillas. De forma similar a lo observado en el porcentaje de semillas viables (Fig. 10), la desinfestación de semillas con NaClO y CaCl2O2 después del proceso de crioconservación en NL, no afectó la germinación in vitro (Fig. 10). Contrario a nuestros resultados, en otras orquídeas como Calanthe discolor Lindl. se han reportado estímulos en la germinación de 88.2% por efecto del NaClO (25%) comparado con el testigo sin desinfestar (Bae et al., 2015). Sin embargo, algunos reportes indican disminución en los porcentajes de germinación para semillas de Oncidium longicornu y O. bifolium con concentraciones de NaClO mayores al 0.5% (Billard et al., 2014).

Efecto del tipo de desinfectante sobre la germinación de semillas de Laelia autumnalis después de la inmersión en nitrógeno líquido (E3).

Las semillas de Phaius tankervilleae desinfestadas con NaClO (1% cloro disponible) adicionado con Tween-20 al 0.05% durante 10 min, previo a la exposición de la solución vitrificadora (PVS2) de 0 - 120 min no sobrevivieron, debido probablemente a la adición de humedad durante la desinfestación (Hirano et al., 2009). Para las semillas de L. autumnalis estudiadas en esta investigación ocurrió algo similar cuando éstas fueron desinfestadas antes de la inmersión en NL, por tal motivo para la crioconservación exitosa se recomienda desinfectar las semillas maduras después de la inmersión a NL.

Conclusiones

El tipo de desinfectante y método de secado afectan la viabilidad y germinación in vitro de semillas de Laelia autumnalis. Los resultados indican que las semillas deben desinfestarse con CaCl2O2 y secarse con aire de la campana de flujo laminar después de la crioconservación por inmersión directa para evitar daños en los tejidos.

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Historial:
  • » Recibido: 18/02/2019
  • » Aceptado: 01/08/2019
  • » : 24/11/2019» : 11/2019

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